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Concept
Pyroséquençage
Résumé
Le pyroséquençage est une technique de séquençage de l'ADN qui permet d’effectuer un séquençage rapide et à moindre coût qu’un séquençage par la méthode de Sanger. En effet, cette technique ne nécessite pas de clonage (donc gain de temps et d’argent), et permet une lecture directe de la séquence obtenue après le séquençage. Elle est basée sur le principe du « séquençage par synthèse », dans lequel le séquençage est effectué en détectant le nucléotide incorporé par une ADN polymérase. Le pyroséquençage s'appuie sur la détection, par quantification de lumière émise, du pyrophosphate libéré lors de la réaction en chaîne, d'où le nom de pyroséquençage.
Le principe du pyroséquençage a d'abord été énoncé en 1993 par Pettersson, Uhlen et Nyren en combinant la phase solide du séquençage utilisant des billes magnétiques enveloppées de streptavidine avec de l'ADN polymérase recombinante n'ayant pas d'activité 3'-5' exonucléase (permettant la correction sur épreuves ou proof-reading) et de la détection de luminescence via l'activité enzymatique de la luciférase. C'est donc un mélange de trois enzymes (ADN polymérase, ATP sulfurylase et luciférase) et un nucléotide (dNTP) qui est ajouté à un simple brin d'ADN que l'on veut séquencer, et l'incorporation du nucléotide est suivie en mesurant la quantité de lumière émise. L'intensité de la lumière détermine si 0, 1 ou plusieurs nucléotides ont été incorporés, ce qui permet de voir combien de nucléotides complémentaires sont présents sur le brin matrice. La mixture d'enzymes avec le premier nucléotide est ensuite retirée du milieu avant qu'une autre mixture avec le deuxième nucléotide soit ajoutée. Ce processus est répété avec chacun des quatre types de nucléotides jusqu'à ce que la séquence d'ADN du simple brin matrice soit déterminée.
Une seconde méthode de pyroséquençage a été développée en 1998 par Ronaghi, Uhlen et Nyren. On ajoute une enzyme en plus, l'apyrase, qui a pour rôle de dégrader les nucléotides en surplus qui ne sont pas incorporés par l'ADN polymérase.
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