Gram négatif

Les bactéries à Gram négatif sont mises en évidence par une technique de coloration appelée coloration de Gram. Les bactéries à Gram négatif apparaissent alors roses au microscope. La technique de coloration révèle des caractéristiques membranaires et de paroi de la bactérie. Néanmoins, il ne s'agit pas d'un facteur de classement phylogénétique : en effet, les groupes Gram + et Gram − ne sont ni l'un ni l'autre monophylétiques. Après fixation des bactéries sur une lame (deux méthodes possibles : fixation à l'éthanol à 90° (5 minutes) ou par passage de la lame dans la flamme, dite frottis) : la lame est plongée dans un premier colorant : le violet de gentiane (1 minute). Le violet de gentiane, toxique et cancérigène, est un colorant puissant. Il va traverser les parois et membranes des bactéries et se fixer dans leurs cytoplasmes. Ainsi à cette étape toutes les cellules sont colorées en violet ; la lame est ensuite traitée au lugol (diiode) en solution qui sert de mordant (30 secondes) : il va renforcer le violet de gentiane contenu dans le cytoplasme des bactéries ; on chasse ensuite le violet avec une solution d'éthanol à 90°. Cette étape est cruciale car permet de discriminer les bactéries Gram négatif des bactéries Gram positif. Le principe est le suivant : les bactéries Gram négatif possèdent une paroi pauvre en peptidoglycane, composant qui en raison de sa faible quantité va permettre à l'alcool d'emporter le violet de gentiane, celui-ci disparaissant du cytoplasme. La bactérie est donc décolorée (pour plus d'information, voir les caractéristiques des bactéries Gram négatif) ; la lame, après avoir été rincée, est plongée brièvement dans un deuxième colorant, la fuchsine (1 minute). Ce colorant traverse toutes les parois et membranes et va colorer en rose toutes les bactéries qui ont été décolorées durant l'étape précédente ; les bactéries Gram positif étant colorées en violet (plus sombre) n'apparaîtront pas rose (plus clair). La lame est ensuite récupérée, rincée et séchée, puis observée au microscope optique généralement à l'objectif x100 + huile à immersion.