Mytilène (en grec moderne : ; en grec ancien : ou ; Midilli) est la principale ville de Lesbos, l'île grecque de la mer Égée souvent aussi appelée Mytilène du nom de sa capitale. Elle constitue le siège du dème de Mytilène depuis le programme Clisthène I de 2019.
Elle est bâtie sur la pointe sud de l'île, à proximité de la côte turque.
Les habitants sont les Mytiléniens ou, plus rarement, les Mytilènes.
Mytilène est, dès l'Antiquité, la principale cité de Lesbos. Elle est peuplée d'Éoliens venus de Thessalie et de Béotie au cours du . Avant la fin du , elle participe activement à la colonisation grecque, en particulier vers la Troade, l'Hellespont et la Thrace ; elle envoie également des colons à Naucratis. Elle est dominée par deux genoi (clans) aristocratiques, les Penthilides, des Atrides descendants du légendaire roi Penthilos, fils d'Oreste, et les Cléanactides. La cité est d'abord gouvernée par un roi, puis par une assemblée oligarchique. Au , elle est gouvernée par le tyran Mélanchros, qui finit assassiné, puis par le tyran Myrsilos qui place les autres cités de l'île (Pyrrha, Antissa et Érésos) sous son autorité, sauf Méthymne. Au début du , Pittacos, l'un des Sept Sages, est appelé pour gouverner sa cité natale comme aisymnète.
Ville natale d'Alcée, elle est alors l'un des centres majeurs de la poésie lyrique illustrée par la poétesse Sappho.
Au , elle passe sous domination perse. Lors de la révolte de l'Ionie, les citoyens lapident le tyran Kôés et participent à la révolte contre les Perses ; en 493, l'île et la ville sont pillées, systématiquement ratissées par les Perses. Libérée au terme des guerres médiques, elle adhère à la Ligue de Délos. Contrairement aux autres alliés d'Athènes, elle ne verse pas de tribut (phoros), mais équipe ses propres trières et envoie ses propres troupes combattre aux côtés des Athéniens. De ce fait, les Mytiléniens se considèrent comme indépendants. La cité aristocratique se révolte en contre l'impérialisme athénien — Thucydide consacre à cet épisode de la guerre du Péloponnèse les cinquante premiers paragraphes de son livre III.