Les glycosyltransférases (ou glycosyl-transférases, abrégé GT) sont des enzymes avec un numéro E.C. de type 2.4.x.x, qui catalysent le transfert d'un monosaccharide, depuis un sucre activé (donneur), généralement par un phosphate, vers une molécule accepteur (le plus souvent un alcool ou une amine).
Le produit d'une telle réaction peut être un oligosaccharide ou un polysaccharide; bien que certaines glycosyltransférases catalysent le transfert de sucres vers un phosphate inorganique, ou les libèrent dans l'eau.
L'accepteur du transfert peut aussi être un résidu protéique, le plus souvent la tyrosine, la sérine, ou la thréonine lors des O-glycosylations, ou une asparagine lors d'une N-glycosylation. Un mannose activé peut être transféré sur un tryptophane pour former un C-manosyl tryptophane, retrouvé fréquemment chez les eucaryotes.
Il est courant qu'un dérivé nucléotidique serve de donneur de sucre. Les glycosyltransférases utilisant ce type de substrat sont appelées enzyme de Leloir, d'après le scientifique qui découvrit le premier monosaccharide activé par un nucléotide, Luis F. Leloir, prix Nobel de chimie en 1970 pour ses travaux sur le métabolisme des glucides.
Les glycosyltransférases n'utilisant pas de donneur nucléotidiques mais un substrat de type polyprénol pyrophosphate ou polyprénol phosphate, ou encore sucre activé directement par un groupe phosphate ou pyrophosphate. Ces enzymes sont retrouvées chez un grand nombre d'organisme.
Les glycosyltransférases, par analogie avec les glycosylhydrolases, catalysent le transfert de l'ose selon un mécanisme qui conserve (rétention) ou inverse la configuration du carbone glycosidique. La plupart des glycosyltransférases sont métallo-dépendantes, envers le magnésium, ou le manganèse, qui jouent le rôle d'acides de Lewis en acceptant les électrons du groupe activateur.
Les glycosyltransférases des mammifères ne reconnaissent que 9 composés nucléotides-sucres différents comme substrat : l'UDP-glucose, l'UDP-galactose, l'UDP-GlcNAc, l'UDP-GalNAc, l'UDP-xylose, l'UDP-acide glucuronique, le GDP-mannose, le GDP-fucose et le CMP-acide sialique.